蜡质基因(waxy, Wx)，是编码直链淀粉合成的关键基因，它通过编码淀粉粒结合淀粉合成酶来控制水稻胚乳中直链淀粉的合成，于1990年成功被克隆(Wang et al., 1990)。近年来研究表明，不同品种直链淀粉含量高低由该品种Wx基因第1内含子的剪切效率所决定(Wang et al., 1995)，而剪切效率受第1内含子中供体+1位碱基是正常型的G还是突变型的T所控制(Cai et al., 1998)。基于此原理，蔡秀玲等(2002)创立了Wx基因的PCR-AccI分子标记，该标记经PCR扩增后，用AccI酶消化，以2%的琼脂糖凝胶电泳后，GG基因型的DNA模板仅出现403 bp片段，TT基因型的DNA模板仅有460 bp条带，而GT杂合基因型同时有403 bp和460 bp条带。利用该标记对63个水稻亲本进行了检测，结果表明，GG基因型的水稻品种直链淀粉含量在20%-32%之间，而TT基因型的直链淀粉含量都小于18%。随后，Mao等(2004)建立了能特异扩增第一内含子+1位正常G碱基的一步PCR显性标记，但该标记在PCR扩增时需将退火温度提高到67℃以提高扩增特异性，因而其缺点是扩增要求较高，容易出现PCR扩增失败而造成G碱基检测不到的现象。

直链淀粉含量是影响稻米蒸煮和食味品质的重要因子。因此，开发出有效的Wx功能标记具重要意义。而以上两种功能标记缺点显而易见，一种是需要酶切消化，因而成本较高，操作繁琐而不利于高通量的分子标记辅助育种；另一种虽然是基于SNP设计的显性分子标记，但退火温度较高而较难把握，如退火温度偏低，则该位点无论是G或为T均可扩增出条带，而退火温度偏高，则很难扩增出条带。有鉴于此，本文设计了一种基于该SNP带阳性对照的功能标记M-Wx，该标记在退火温度为55℃时即可正常扩增，1.2%琼脂糖凝胶电泳后可检测等位碱基的差异。本研究通过检测72个水稻亲本基因型与直链淀粉含量的关系，来验证该功能标记M-Wx的有效性，从而M-Wx应用于直链淀粉的育种应用提供一定理论基础和实践意义。

1结果与分析
1.1引物设计
根据引起蜡质基因功能变化的单碱基突变，G-T差异位置的序列设计能特异扩增突变型T的引物WxT，并在3'端第四个位置引入一个错配以加强特异性，在其上游和下游分别设计一条正向引物WxF、下游设计一条反向引物WxR (表1)。当水稻DNA模版在该G-T位置有为TT型或GT型存在时，将会扩增出228 bp和428 bp两条带，而该位置为GG型时，则只有425 bp的对照条带(图1)。

表1 标记M-Wx信息表 Table 1 Information of marker M-Wx

图1 M-Wx扩增示意图 Figure 1 Diagram of PCR amplification with primers

1.2标记M-Wx在水稻亲本中的等位分布与直链淀粉的相关性
为了检验功能标记M-Wx检测的基因型与直链淀粉含量的相关性，我们选择了72份遗传稳定、Wx基因为纯合状态的水稻亲本。用标记M-Wx经PCR扩增，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后发现，72个亲本均扩增出产物，出带率为100%，且条带清晰(图1; 图2)。有43份水稻亲本有228 bp和425 bp两条带，基因型记为TT，其直链淀粉均小于15.3%，其直链淀粉的平均值为12.5%；有29份水稻亲本只有425 bp条带，基因型记为GG，其直链淀粉均高于20.7%，其直链淀粉的平均值为22.3% (表2)。结果表明， M-Wx检测72份水稻亲本的基因型与直链淀粉含量的表型完全吻合，M-Wx检测为TT型的42份非糯性水稻亲本直链淀粉含量为9.1%-15.3%；M-Wx检测为GG型的29份水稻亲本直链淀粉为20.1%-25.6%。因此，M-Wx能有效跟踪蜡质基因Wx第一内含子5'端剪切处发生一个G->T的SNP突变，从而成为一个有效的功能标记。从直链淀粉的检测结果看，蜡质基因Wx稻米的直链淀粉含量影响巨大，基因型为TT的亲本比基因型为GG的亲本的直链淀粉含量平均少9.8%。

图2 标记M-Wx检测72份水稻亲本电泳图 Figure 2 72 rice germplasm, using marker M-Wx tested

表2 72份水稻亲本直链淀粉含量及M-Wx检测基因型 Table 2 Gene-type by M-wx and amylose content of 72 rice germplasm

2讨论
本研究用新建立的蜡质基因的功能标记M-Wx对72份水稻材料进行了检测，在正常PCR条件下扩增完成后直接进行1.2%的琼脂糖凝胶电泳，72份材料均有条带，且条带清晰，能准确辨别亲本为GG型或TT型。相较于前人建立的两种功能标记而言，操作简便、经济，符合水稻育种的大批量检测。

目前主栽三系杂交稻亲本中，三系保持系的直链淀粉偏高，这是导致目前三系杂交稻米质差的一个因素。以蜡质基因Wx基因型为TT的三系保持系宜香B、粤丰B等为材料，利用标记M-Wx可以应用于选育低直链淀粉的三系保持系。本课题组将该功能标记M-Wx用于水稻三系不育系的育种实践，选育了一批低直链淀粉的不育系，其中一个不育系命名为62A测配杂交组合表现优异，所配的杂交组合62A/辐恢838已经通过广西区试筛选实验，进入复试(未发表)。从本课题组的育种实践看，M-Wx标记对检测样品出带率高，条带清晰，符合水稻育种的大批量检测的需求。

3材料与方法
3.1供试材料
供试材料是广西常用的遗传稳定的72份水稻亲本材料(表2)。

3.2水稻亲本直链淀粉的测定
供试材料于2010年早稻统一种植在广西农科院试验田，成熟后收获。按国家标准(GB/T15683-1995)在广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室测定稻米直链淀粉。

3.3水稻基因组DNA提取
待到72份水稻亲本材料插秧后20 d，分别取其叶片，置于-20℃冰箱保存。基因组DNA的提取按Murray和Thompson (1980)的CTAB法进行。

3.4 PCR扩增
PCR反应体系采用10 μL的体系，含1.0 μL 10×Buffer，0.2 μL dNTP，三种引物各0.5 μL 4 mol/L，0.1 μL Taq酶，1.0 μL 模板DNA，ddH2O补足10 μL。配置反应体系的过程均在冰上操作，待PCR反应温度上升到94时才将PCR板放入PCR仪进行扩增，以减少引物二聚体的形成。PCR反应程序94℃ 5 min，然后35个循环94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶中电泳，GelRed生物染剂染色，紫外灯下观察拍照。

作者贡献
高利军是本研究的实验设计和实验研究的执行人；周萌、陈仁天完成数据分析，论文初稿的写作；高汉亮、颜群和戴高兴负责稻米直链淀粉的测定；周维永和梁海福参与实验设计，试验结果分析；邓国富是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。该文为全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由广西“八桂学者”专项、“十二五”国家科技计划课题(2012AA101201-2)、国家国际科技合作项目专项(2012DF131220)、广西“十二五”科技攻关项目(20100005-2)、 广西自然科学基金(2010GXNSFA013085)和广西农科院基金(201013）共同资助。感谢李映照研究员为本研究提供部分水稻材料。

参考文献
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Cai X.L., Wang Z.Y., Xing Y.Y., Zhang J.L., and Hong M.M., 1998, Aberrant splicing of intron 1 leads to the heterogeneous 5' UTR and decreased expression of waxy gene in rice cultivars of intermediate amylose content, Plant J., 14(4): 459-465
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Mao X.X., Liu Y.Z., Xiao X., Chen J.W., Luo W.Y., and Li X.F, 2004,  A one-step pcr method for detecting the first base of splice donor of wx intron 1 in rice,  Rice Science, 11(5-6): 342-344

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